【组织切片】制作冷冻组织切片到底有哪几步

　　制作冷冻组织切片的过程其实是非常麻烦的，它所需要的步骤非常的多，并且每一个步骤都得非常精细不能出现一点点失误。这种切片的厚度也是有一定的规定的，并且标本在制作完之后一定要标记卡片，然后再放入液氮中去。接下来，中药标本厂家就来大家了解下制作冷冻组织切片到底有哪几步及植物抑制标本的过程。

　　1.将未受损伤的组织切剖成小样本，约lcmXIcmX0.4cm。

　　2.将标本放在卡片的一端。标记该卡片，将带有标本的一端浸入液氮中。60s后，取出标本并放在干冰上。修剪卡片，使其大小刚好比组织块稍大些，转入预冷的(-70℃)带有标记的小瓶中。

　　3.切片前，用1％明胶包被洁净的载玻片。加热至50℃使明胶溶于水中，冷却，加入0.02％叠氮钠。将玻片浸入明胶溶液中30s，取出，自然干燥。

　　4.按照仪器使用说明书，用低温恒温器制备冷冻切片。通常切片厚度在5-10gm之间。用包被过的载玻片收集切片。

　　5.让切片自然干燥。浸入新鲜配制的4％多聚甲醛中2min。

　　6.用PBS洗数次，放入含1％NP-40的PBS中5rain。用PBS洗数次。

　　7.将带有组织切片的载玻片放在湿盒中。加合适稀释度的一抗，用含蛋白质的溶液如3％BSA／PBS稀释抗体。

　　单克隆抗体最好选用杂交瘤细胞培养上清(特异性抗体浓度为20-50gg／m1)。小鼠腹水、纯化的单克隆抗体和多克隆抗体，以及粗制的多克隆抗血清应该测试其稀释度，以使特异性抗体的浓度在0.1～10ug／m1之间。如果特异性抗体的浓度是未知的，则制备并测试初始制品的不同稀释度(1：10，1：100，1：1000和1：10000)。

　　8.将玻片置湿盒中于室温下孵育至少60min。对于某些反应来说，孵育时间可延长至24h，以增加其敏感性。

　　9.用PBS洗3次，每次5min以上。

　　10.加辣根过氧化物酶标记的二抗(特异性针对一抗)。这些试剂可以购自不同的经销商。如果二抗的确切用量是未知的，测试1：50—1：1000稀释的二抗。用含蛋白质的PBS稀释，如3％BSA／PBS。

　　11.将样本置湿盒中，于室温下孵育30min。

　　12.用PBS洗3次，每次5min以上。

　　13.配制DAB／金属盐试剂。将6mgDAB溶于9ml0.05mol／LTris缓冲液(pH7.6)中。加lm[0.3％(W／V)氯化镍贮存液(可用相同浓度的氯化钴代替)。加0.1ml3％过氧化氢。如果出现沉淀，用Whatman1＃滤纸(或相似品)过滤。

　　14.将上述溶液加到标本中。在低倍光学显微镜下观察。当形成足够的棕／黑色沉淀时，用水冲洗以终止反应。通常这一反应过程约需1-20min。

　　15.加数滴Harris苏木精。孵育约5min。时间长短取决于染色的强度。

　　16.用水轻柔冲洗。

　　17.通过各级乙醇使标本依次脱水。在75％乙醇中孵育两次，每次3min，95％乙醇中2次，每次3min，100％乙醇中2次，每次3min。自然干燥。

　　18.加一小滴DPX至标本上。小心在其上面放一盖玻片(1＃)避免产生气泡。用纸巾去除多余的液体。DPX很快可以凝固，样品便可观察并照相。